Diabetologia：激活但功用受损的记忆Tregs在1型糖尿病患者进展缓慢的过程中逐渐扩展

从第一次显现家兔自身免疫球蛋白到显现1HG白血病诊疗症状的成果亲率在成年人时期就有很差的详细描述，多个家兔自身免疫球蛋白特征性的成年人当中有70%在血清变换后10年内复发白血病，而随访15年的成年人这一比例上升到84%。相来得之下，占有诊疗1HG白血病一半以上的HG1HG白血病的发病有助于还不会赢取充分的深入研究。

越来越多的人开始常用分期的系统来假定1HG白血病的成果：幼体在显现多种家兔自身免疫球蛋白时离开第1下一阶段，显现血糖异常时离开第2下一阶段，显现症状时离开第3下一阶段。一些多发家兔自身免疫球蛋白特征性的幼体，在1期和2期，成果较慢，并拓展为发病的1HG白血病。我们之前详细描述了一第各别在首次扫描到多种家兔自身免疫球蛋白样本后至少10年无白血病的亦然慢成果者，这第各别病征人数少，但相似性非常明确。随后，我们发现家兔自身淋巴细胞会特异性CD8+T细胞会自由基在成果加速的病征当中基本不发挥作用，但在同类HG发病和长期发挥作用的白血病病征当中很难以扫描到。这可能说明了，与成果病征相来得，这些病征自身免疫自由基的调节增强。

更早深入研究说明了，尽管调节性T细胞会(Treg)使用量正常，但白血病病征发挥作用一些功能缺陷，其当中除此以外对IL-2的自由基能力减低。此外，白血病病征当中的不稳定性CD4+T细胞会可能对调节更具抵抗性，表现为不稳定性T细胞会的消除弱化，自然产生的Treg和活体产生的诱导Treg，以及淋巴细胞会亲身经历的CD4+T细胞会当中IL-2自由基弱化。本深入研究的目的是详细描述了CD4+调节性T细胞会(Treg)在在在亦然加速成果者当中的相似性，他们的平均年龄为43岁(31-72岁)，随访一段时间为18-32年。

方法：BOX深入研究是一项以人群为基础的侧向深入研究，在21岁此表确诊的病征家庭成员当中检查1HG白血病的危险因素。我们之前详细描述了长期加速成果者的相似性，他们保持良好多重家兔自身免疫球蛋白特征性最少10年，但不会显现白血病的诊疗症状，慢性或非展开性自身免疫。随后，10名在此期间保持良好无白血病并情愿提供大量肝脏样本的加速成果者确立T和B细胞会功能深入研究。在目前的深入研究当中，8名慢成果者(SP第各别)，当中位年龄43岁(31-72岁)，18 - 32岁之间的家兔自身免疫球蛋白特征性。所有的行动者都受制于1HG白血病成果的1期，尽管一些人随后失去了家兔自身免疫球蛋白对某些淋巴细胞会的特征性自由基，然而，一名病征已经受制于2期至少6年，但不会显现诊疗症状，一名病征被病因为白血病，该病患72岁，在热带植物科学实验样本时，其HbA1c升高到53 mmol/mol(7%)，在数据深入研究当中对该NAD展开了单独评量。复合外周血单个核细胞会(PBMCs)，引入多参数流式细胞会术和T细胞会消除检验评量NAD当中Treg的频亲率、变异和功能。常用FlowSOM和CITRUS(聚类比对、也就是说和重回)展开无监督聚类深入研究，评量Treg变异。

结果：与身体健康NAD相来得，来自慢成果体的无意识CD4+T细胞会的监督聚类揭示，激活的无意识CD4+ Treg频亲率上升，与糖皮质激素诱导的TNFR相关蛋白(GITR)突显上升有关。一名HbA1c升高的病征与成果加速者和归一化的对照第各别相来得，Treg谱不尽相同。功能深入研究说明了，与身体健康NAD相来得，来自加速成果体的Treg抑制的CD4+不稳定性T细胞会消除明显损伤。表现为对不稳定性CD4+T细胞会CD25和CD134突显的消除上升。

平面图1 深入的变异深入研究揭示，CD4+Treg亚HG在慢成果函数调用当中上升。由FlowSOM转化成的Treg室，组织起来在来自所有NAD的活CD4+CD45RA -细胞会上。根据标明物突显比对借助于10个元簇:无意识T细胞会_1;无意识T cell_2;无意识T cell_3;无意识T cell_4;CD49b无意识T细胞会;HLA-DR + GITR +无意识T细胞会;CPUTreg_1;CPUTreg_2;CPUTreg_3;和CPUTreg_4。(a)常用9个不同Treg标明转化成的10个元簇的MST。每个路由器代表者一个战略性(100个战略性)，非常大的元战略性(10个元战略性)在路由器第各别周围上色。每个路由器当中的饼平面图指出单个标明的突显等级。(b)每个元聚类的热平面图，以揭示整体标明突显。(c, d)为HD第各别(c)和SP第各别(d)转化成平面图，以及FlowSOM鉴别的每个元簇的表层。(e-l)相来得丰度为每个metacluster装入当中央线平面图(丰度> 0.05%)确定为HD和SP第各别:CPUTreg_2 (e),CPUTreg_3 (f),CPUTreg_4 (g), HLA-DR + GITR +无意识T细胞会(h)、无意识T cell_1(i),无意识T cell_2 (j),无意识T cell_3 (k) n d CD49b无意识T细胞会(l)。紫色红色代表者**SP 606。**p< 0.01, Wilcoxon配对符号秩检验。此键适用于平面图形部分(a)， (c)， (d)和d (e-l)

平面图2 常用CITRUS的系统结构证实，Treg频亲率的上升是成果加速的图案。分级门控(a - f)和柑橘深入研究(g-k)来得SP行动者和归一化的HD行动者在CD4+CD45RA−T细胞会上的差异。(a)杂交CD25+ cd127 lotreg和CD25loCD127+T c e l群体的代表者性平面图。CD25+ cd127lotreg被CD39和FOXP3富集，然后通过HLA-DR和GITR突显展开复合，模拟器FlowSOM群体。(b) HD(黑点)和SP(蓝点)第各别以及NADSP 606(紫色)当中CD25+ cd127的频亲率汇总平面图。(c-f) CD25+CD127loCD39+FOXP3+和CD25loCD127+门控子集的装入当中央线平面图;(c) HLA-DRloGITR−(CPUTreg_2)， (d) HLA-DRintGITRlo(CPUTreg_3)， (e) HLA- d RhiGITR+(CPUTreg_4)， (f) HLA- d RhiGITR+(HLA-DR+GITR+CPUT cell)。(g - i)柑桔簇臂由(g) CD127， (h) CD25和(i) FOXP3突显风速制做，上标突借助于的簇被鉴别为SP和HD函数调用之间的不同。(j)装入当中央线平面图揭示了在SP(蓝点)和HD(灰点)第各别当中，CITRUS无意识Treg_3和Treg_4的相来得丰度(比例)。(k)直方平面图揭示每个簇的变异(粉红色)和Treg标明相来得突显与历史背景突显(蓝色);上列，CPUTreg_3;下面恰巧，CPUTreg_4。历史背景与所有其他簇当中标明的突显有关。*p< 0.05， **p< 0.01, Wilcoxon配对符号秩检验

平面图3 与身体健康献血者相来得，成果加速者无意识treg的GITR上升。每个无意识CD4+T细胞会元簇(无意识T细胞会_1;无意识T cell_2;无意识T cell_3;CD49b +无意识T细胞会;HLA-DR + GITR +无意识T细胞会;CPUTreg_2;CPUTreg_3;来自FlowSOM的memory Treg_4)扫描每个突显标明的变化。(a,b)来自HD (a)和S (b)函数调用的突显热平面图(sp606不除此以外在内)。(c,d)无意识Treg_4元簇当中所有HD(灰色)、所有SP(蓝色)和SP 606(紫色)的FlowSOM GITR突显并联，揭示直方平面图(c)和汇总平面图(d)。Wilcoxon配对符号秩和检验，p< 0.07(紫色)所有NAD除此以外，p< 0.05(蓝色)NADSP 606和归一化的HD不除此以外在测试当中。(e,f) HLA-DRhiGITR+Tregs当中GITR突显，从分级门控，从所有HD(灰色)、所有SP(蓝色)和SP 606(紫色)并联，揭示直方平面图(e)和汇总平面图(f) *p< 0.05, Wilcoxon配对符号秩检验

平面图4 来自加速成果的CD4+ treg细胞会控制不稳定性CD4+T细胞会的能力减低。SP第各别用蓝色的当中央线和红色指出，HD第各别用蓝色的当中央线和红色指出，紫色的当中央线/红色指出NADsp606。常用CD4+CD25+ Treg分选试剂盒对CD4+T细胞会展开分选。CD4+CD25−(；也者)被标明为CFSE, Treg按检视的比例滴定。用抗CD3 /28微珠还原细胞会，培植3紧接著展开流式细胞会术扫描。(a-d)与CD4+；也者相来得应的treg培植(内皮)(e-h) HD、SP或SP 606 Treg与HD；也者培植。(a,b,f) CFSE增殖(a,e)和CFSE消除比亲率(b,f)。(c, d,h) CD25 (c,g)和CD134 (d,h)的消除比亲率。常用特征性对照(激活的自发细胞会不含treg)计算消除比亲率。*p< 0.05， **p< 0.01， ***p< 0.001，重复测量双向方差深入研究。†p < 0.0 5 Bonferroni的事后多重来得测试

平面图5 不稳定性CD4+T细胞会对加速成果的T细胞会还原的消除更敏感性。SP第各别用蓝色的当中央线和红色指出，HD第各别用蓝色的当中央线和红色指出，紫色的当中央线/红色指出NADsp606。常用CD4+CD25+Treg分选试剂盒对CD4+T细胞会展开分选。CD4+CD25−(；也者)被cfsel标明，treg按检视的比例滴定。用抗CD3 /28微珠还原细胞会，培植3紧接著展开流式细胞会术(CD25反染)和细胞会因子深入研究。HD Treg与HD、SP或sp606；也者协力培植。(a,b) CFSE增殖(a)和CFSE消除次之(b)。(c,d) CD25消除次之(c)和CD134消除次之(d)。(e,f) IFN-γ(e)和IL-17A (f)在共培植当中的突显。***p< 0.001， **p< 0.01，重复测量双向方差深入研究。†p < 0.0 5 Bonferroni的事后多重来得测试

论证：我们计算借助于来的论证是，来自加速成果子的还原无意识CD4+Treg在GITR突显当中赢取了扩展和丰富，突显了进一步深入研究Treg在1HG白血病风险幼体当中的异质性的必要性。

文当中说是：

Boldison J, Long AE, Aitken RJ,et al.Activated but functionally impaired memory Tregs are expanded in slow progressors to type 1 diabetes.Diabetologia 2021 Oct 28